Nirvana 1 Immunolabeling Kit

Nirvana 1 Immunolabeling Kit

中文名称：涅槃一号超分辨免疫标记全套试剂盒

CAT：HX-NIP001

Product Specifications and Storage Methods（试剂盒组分与储存条件）

⚠️重要提示：试剂盒内部各组分储存条件不完全一致，收到试剂盒后，请拆分组分，按照上表条件分开存放；切勿统一放置同一温区。

1、产品功能

Nirvana 1 Immunolabeling Kit（涅槃一号超分辨免疫标记全套试剂盒），为贴壁细胞超分辨免疫荧光制样一体化全套试剂盒。整合从细胞培养载体、样本固定、自发荧光淬灭、封闭打孔、抗体孵育完整链路试剂耗材。专门面向 SIM、STED、STORM 等超分辨荧光显微成像，可同时实现微管、微丝、线粒体、高尔基体、溶酶体等多种细胞器的高保真保存与免疫标记，一站式解决传统制样流程中细胞质流失、细胞器解聚、内源自发荧光高、抗体非特异性吸附、孵育耗样大等痛点。

- 本试剂盒适用于贴壁细胞样本；不适用悬浮细胞。

- 本试剂盒不含一抗、二抗、荧光染料，需用户自备。

- 高保真固定步骤需要严格维持 37℃，保障高保真固定液发挥最佳效果。

2、完整实验 Protocol（Nirvana1 全套工作流程）

前置准备：使用试剂盒内【Sunbloss® 高平玻底成像皿‑独立装】接种贴壁细胞，推荐接种密度 30‑50%，培养至细胞汇合度 50‑70%，细胞状态良好，无明显凋亡、皱缩。可按需叠加细胞贴壁辅助液包被。

2.1 试剂预热与配制

1. 将试剂盒内Sunbloss® 超纯制样 PBS、Sunbloss® 高保真固定液‑多细胞器全部组分放置 37℃充分预热。

2. 新鲜配制高保真固定工作液：吸取 500μl Solution I + 200μl Solution II +500μl General Multiple Organelle Types Buffer，EP 管混匀；固定液现配现用，不可久置，单次建议固定样本不超过 3 个。

3. 自发荧光抑制剂工作液：取试剂盒内粉末，使用试剂盒内超纯制样 PBS 按照说明书配置为 1mg/ml 工作液，配置完成 1min 内必须使用。

4. 封闭打孔工作液：Solution I 融化后，取 500μl PBS+500μl Solution I +50μl Solution II 充分混匀，现配现用。

2.2 样本高保真固定

1. 取出培养好细胞的高平玻底成像皿，沿皿侧壁加入预热的 Sunbloss® 超纯制样 PBS 润洗细胞 2 次，第二次润洗后尽量吸干液体，严禁干片。

2. 滴加新鲜配制完成的高保真固定工作液，液体完全覆盖细胞底面；全程维持 37℃环境（金属浴 / 细胞培养箱），固定 10min。

3. 固定结束，使用 25℃超纯制样 PBS 沿侧壁轻柔润洗样本 3 次。

2.3 自发荧光淬灭处理

1. 吸净 PBS，加入足量自发荧光抑制剂工作液完全浸没样本，摇床转速≤60rpm，孵育 7min。

2. 弃去淬灭工作液，超纯制样 PBS 清洗样本 3 次。

(现用现配1Min内使用本试剂)

2.4 封闭与打孔通透

1. 吸干清洗 PBS，滴加封闭打孔工作液；使用试剂盒内Sunbloss® 制样伴侣‑贴壁样本覆盖样本表面，室温孵育 30min。提示：无制样伴侣条件下，20mm 玻底皿建议工作液用量≥250μl，必须完全浸没样本。

2. 孵育结束，小心揭除制样伴侣。后续一抗、二抗孵育建议继续使用本封闭打孔工作液作为孵育基底溶液，持续维持通透、低背景环境。

2.5 抗体孵育与后续成像准备

1. 稀释自备一抗，滴加样本表面，配合制样伴侣进行孵育；孵育结束 PBS 充分洗涤。

2. 稀释自备荧光二抗，避光孵育，完成后 PBS 充分洗涤。

3. 可直接上机进行常规荧光、SIM/STED/STORM 超分辨成像。

补充说明：试剂盒内的 Sunbloss® 超分辨光镜级 PFA‑16% 为备选补充固定母液；当用户需要调整固定浓度时，可稀释使用，推荐工作浓度不低于 4%；高保真固定优先使用试剂盒配套的多细胞器高保真固定液。

2.6 后固定样品

1. 后固定：取试剂盒内的 Sunbloss® 超分辨光镜级 PFA‑16% 为备选补充固定母液；用PBS稀释为4%PFA,取4%PFA，250ul以上，迅速轻柔加入小皿，后固定10min，1*PBS清洗三遍，ddH2O清洗三遍，在阴凉不见光处（无湿盒）自然放干，4小时以上或进行封片操作。

3、试剂盒产品优势

1. 一体化全套制样方案：从成像载体、固定试剂、淬灭试剂、封闭打孔试剂到孵育耗材全部配齐，无需零散采购，减少不同品牌试剂兼容性风险，完整适配超分辨免疫标记。

2. 多细胞器同步高保真保存：Sunbloss®高保真固定液-多细胞器缓冲体系，最大程度规避细胞质流失、微管 / 微丝解聚、膜细胞器泡状弥散问题，实现骨架与多种膜细胞器同时高质量固定。

3. 双重降噪体系：自发荧光抑制剂消除细胞内源与醛固定剂带来的本底荧光；封闭打孔液抑制抗体非特异性吸附，双重提升信号‑背景比，改善单分子超分辨成像定位精度。

4. 节约抗体耗材：配套 Sunbloss® 制样伴侣‑贴壁样本，大幅降低抗体孵育所需液体体积，规避边缘效应，孵育环境均匀稳定，降低昂贵抗体消耗。

5. 成像基底品质保障：配套高平玻底成像皿，170μm±5μm 进口硼硅玻璃，低自发荧光，适配 TIRF 以及各类超分辨显微镜，减少光学畸变。

6. 批次质控严格：所有 Sunbloss® 组分均经过成像级质控，降低批次间差异，提高实验可重复性。

适配成像平台：SIM、STED、STORM、TIRF、共聚焦、普通宽场荧光成像。

4、重要注意事项

1. 各组分储存条件不同，收到试剂盒务必拆分按对应条件储存；自发荧光抑制剂极易吸水失效，必须干燥密封保存，现配现用。

2. 高保真固定步骤，试剂与样本必须维持37℃，温度偏离会直接造成细胞器保存效果下降。

3. 全程所有 PBS 润洗操作沿皿侧壁加入试剂，禁止直接冲击细胞；全程严防样本干片，干片会直接造成细胞形态不可逆破坏。

4. 细胞初始状态直接决定最终成像结果；细胞凋亡、污染、汇合度过高 / 过低，即使试剂盒操作全部正确，也无法获得理想超分辨成像效果。

5. 本试剂盒仅供科研实验使用，不可用于人、动物临床诊断及治疗用途。

6. 试剂出现浑浊、沉淀、变色等异常，禁止继续使用。

7. 自备一抗、二抗的品质、稀释比例会最终影响标记效果，请用户参照抗体原厂说明书进行稀释摸索。

5、细胞准备部分

1.1 样本前处理阶段（细胞间维护、细胞培养）

1.1.1 做好全身的防护和无菌穿戴，进入细胞间。（详情请参考视频）；足部带好鞋套进入缓冲间，口部佩戴口罩、头部佩戴网纱帽、带好手套，全身穿戴防护服，最后，使用手套将防护服的袖子部分包裹进去，用美纹纸缠好封紧手套。

1.1.2 用 75%乙醇喷全身，进行彻底的全身杀菌。

1.1.3 使用 75%乙醇和缘爱无尘吸水纸擦拭任何需要进入生物安全柜的试剂耗材表面；

1.1.4 「用于扩增的母细胞培养」培养细胞时使用Sunbloss®️细胞高活力培养基 AB 液，参考详细说明书：Sunbloss®细胞高活力培养基AB液-使用说明书，该说明书中有详细的细胞培养步骤。该培养基可以让细胞快速唤起高活力的健康状态，成为可制样的超分辨级细胞。

1.1.5 为促进细胞贴壁和延展，使用 Sunbloss®️细胞贴壁辅助液处理细胞的光学玻璃载具，参考详细说明书：Sunbloss®细胞贴壁辅助液-使用说明书

1.1.6 『用于成像的子细胞培养』在母细胞培养好，且预处理子细胞玻璃载具后，准备接种子细胞。需要准备Sunbloss®️高平玻片、或者 Sunbloss®️玻底成像皿TP-φ20，作为子细胞的光学玻璃载具。继续参考Sunbloss®细胞高活力培养基AB液-使用说明书中，详细的子细胞培养步骤。

1.1.8 确保子细胞接种密度在 30%-50%，在 24-28 小时之内，子细胞会贴壁并延展至最佳状态。

请注意，在细胞传代、换液、等过程中使用到的耗材，包括枪头、ep 管、移液管在内，需无菌、无尘、无内毒素。