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分子机器驱动许多至关重要的生命过程。其中，马达蛋白和家族的成员是ATP驱动的分子马达，它们识别细胞骨架的结构极性并定向运动，驱动细胞内运输和细胞分裂等重要的生命过程。自1985年科学家Ronald Vale发现马达蛋白Kinesin以来（1），相关领域已有二百多篇文章发表在顶级期刊（Nature、Science、Cell）上，这其中很大一部分研究成果是利用最新技术来探究马达蛋白在微管上的运动情况。时至今日，马达蛋白相关科学问题仍受到大家热切关注，部分原因是虽然过往的研究帮助人们理解马达蛋白如何行走，但其机械-化学循环的许多细节仍然存在争议或难以观测。3月9日Science同时刊发两篇利用MINFLUX技术在活细胞追踪马达蛋白的文章，足以体现科研界一直以来对该问题的重视，以及对MINFLUX技术解决经典生物问题能力的高度认可。两篇文章分别为：
--对该领域既往工作的简述
图1：背负“货物”的马达蛋白在微管的运动
如示意动画所展示，细胞内的马达蛋白迈着步子沿微管搬运货物。这个运动现象的雏形于1989年提出，是Ronald Vale等人间接观察到的，具体做法是，通过先把马达蛋白固定在玻璃表面，再孵育微管而后观察微管运动间接推断马达蛋白的运动（2）。自这个理论提出以后，各种单子分子检测技术就被不断地应用于该领域的研究之中，对马达蛋白的观测也就逐渐成为了衡量单分子追踪技术的一个重要标准。
在单分子技术中，光镊是研究单分子活动和操纵单分子的重要工具。从1990年开始，科研人员尝试利用光镊技术来研究马达蛋白。在抓取小球标记的马达蛋白后，放置于固定在玻片的微管上进行观测。马达蛋白移动产生的作用力可以通过光镊进行分析，从而揭示它们的动力学特性。得益于自身极高的精度，此后光镊技术一直都作为经典技术来不断探究马达蛋白的精细运动。但时至今日，在该类型实验中，光镊仍需体积较大（100 nm-200 nm）的小球去标记马达蛋白（3-5），实际操作中，难以保证一对一的关系，会存在一个小球上不规则地连有多个马达蛋白的情况；而且因为标记物很大，不能很好地标记在马达蛋白的“脚”上，所以该技术仅能检测蛋白质中心的运动，而不是马达蛋白下方每个“脚”（motor domain）的运动。此外，该技术会使马达蛋白额外受力，不能保证观测到完全自由的蛋白运动。
相比与单分子光镊技术，单分子荧光成像——纳米精度荧光成像 (FIONA)就是为了研究各种马达蛋白应运而生的（7，8）。该技术在体外实验中获取了大量结果，确定了马达蛋白交替迈步的运动方式（hand-over-hand manner）。然而，此技术目前也只限于对体外重组实验进行探究。z向分辨率不高，导致只能从二维尺度收集数据，这也限制了其未来在活细胞上的应用。此外，该技术使用单个荧光分子标记，其信号不足以支撑更高的空间和时间分辨率（追踪轨迹中的一个位置要实现1到2 nm定位精度需要花费上百微秒收集2500个光子）来解析生理ATP浓度（mM）下马达的快速踏步行为，为了提高实验的可行性，人们一般会用低浓度（nM）ATP来降低运动速度进行测量。正因为单分子信号采集的亮度不足，需要时间积累光子的限制，后续高浓度ATP下的快速步态研究转而采用了FRET方法而非单分子示踪。此外，为了追求信号强度以实现活细胞在体观测，科研人员也曾退而采用信号强度高的金颗粒小球来研究马达蛋白在活细胞中的动力学。然而，此类实验中，马达蛋白并没有被直接标记，而是把内吞进活细胞的小球作为马达蛋白的“货物”来观测。但小球被内吞后所形成的囊泡体积巨大，导致介导该囊泡运输的马达蛋白数量和实际运动规律与生理条件下有出入，且难以准确判定。所以，在活细胞内探究马达蛋白真实的步态仍然困难重重。
纵观科研人员研究马达蛋白的历史，我们不难发现，在既往成像实验设计中绕不开一个核心问题：高的定位精度需要以收集大量光子为前提，但收集大量的光子不仅需要更长的时间，也需要更亮的标记物。不幸的是，足够亮度的标记物往往体积较大，不仅影响蛋白的正常运动，也不利于高精度的定位；反过来，虽然单个荧光分子体积足够小，但是不能提供大量光子，这似乎陷入了一个死循环。在以往的技术中，能够提供低至几纳米的高空间分辨率，就不能足够快地跟踪分子；而具有很高时间分辨率的技术，又需要用体积为几百纳米的足够亮的小球进行标记。故此科研人员在既往的文献中曾多次提到，要想更深入地探究马达蛋白就必定需要同时兼顾极高时间和空间分辨率的工具来实现。MINFLUX正是满足这一要求的技术工具。因此，如今人们迫不及待的希望看到最新的MINFLUX技术给这一研究领域带来的变化。
--MINFLUX技术
--如何克服前人所遇到的技术瓶颈？
首先，MINFLUX因其独特的设计思路（传送门：从显微镜到显纳镜——小于2nm定位精度的光学显纳镜MINFLUX），并不以收集大量光子作为高精度定位的前提。而是通过有限的光子信号，引导甜甜圈形状的激发光向接近荧光分子的区域做移动。甜甜圈形激发光的中心点离荧光分子越近，荧光信号越弱。当检测不到任何光子信号时，意味着甜甜圈激发光的中心点和单个荧光分子重合，此时已知的甜甜圈中心坐标就是荧光分子的位置。正是由于这种以最小而非最大光子数来定位荧光分子的方法，收集几十个光子就足以对一个荧光分子进行精确定位，远远低于既往技术对光子数的要求。
故此，在使用MINFLUX的过程中，不需要更大更亮的标记物，不需要担心单个荧光分子不够亮的问题，也就不需要每次都长时间的收集光子。正因为，在单个位置不需要长时间收集光子，可以想象的是，MINFLUX的时间分辨率也很高。在实际的追踪实验中，MINFLUX最快可以实现每100µs就更新一次单分子的坐标。也就是说MINFLUX既可以做到纳米级定位，又能兼顾追踪的速度，这是以往所不可想象的。此外，三维空间上的甜甜圈激光发（传送门：Abberior发布最新3D超高分辨率显纳技术3D-MINFLUX）让MINFLUX在Z向也可以做到纳米级定位。从而让一直以来的2D追踪技术，拓展到了更有利于研究实际生物问题的3D空间。
--近期两篇Science文章的亮点
以往各个课题组在做马达蛋白的运动研究时，全部基于体外重组实验或者固定细胞。这是因为控制马达蛋白的浓度和降低运动速度（减低ATP浓度）之后，追踪难度远小于活细胞样本。为了实现活细胞中的追踪，Jonas Ries课题组首先借助motor-PAINT的方法摸索固定细胞中马达蛋白MINFLUX的成像条件，在固定细胞中实现了约2 nm的定位精度。然后，根据固定细胞的参数去尝试在活细胞中追踪Kinesin，最后在细胞系U2OS和神经元细胞都成功检测到了约16 nm的标准步幅（相当于蛋白中心移动8 nm），而在U2OS细胞中偶尔也能看到8 nm的亚步幅（相当于蛋白中心移动4 nm）。
图2：在活细胞U2OS中追踪全长的马达蛋白
(A) GFP-α-tubulin在未经处理的 U2OS 细胞中的共聚焦图像，并叠加了全长的马达蛋白的轨迹。(B) 在(A)所示的区域中马达蛋白的轨迹被渲染成超分辨率图像。(C) 连接每个定位的轨迹图，以及下方加入时间信息后的轨迹动画。(D) 是（C）轨迹中虚线框部分的时间与位置关系图，显示了 16nm 的步幅。比例尺：（B）和（C），100 nm。
实现活细胞2D追踪后，Jonas Ries课题组又把MINFLUX技术首次用于三维尺度上追踪，复现了马达蛋白在活细胞中真正的运动状态。3D追踪避免了z向投影对xy二维追踪精度的限制，然而传统的单分子追踪只能提供较差的z方向分辨率。MINFLUX通过空间上7个位置的检测（图3，A和B），在x、y和z方向的定位精度分别达到了2.5 nm、3.1 nm和3.9 nm。当与Motor-PAINT一起使用时，可以解析出在微管交叉处马达蛋白在两个微管间的跳跃（图3D的箭头）。在对活细胞三维跟踪中，MINFLUX也能实现类似的空间和时间分辨率（分别为 3.9 nm 和 3.0 ms），进而在三维中解析马达蛋白 16nm 的步幅（图 3，E 和 F）。而这种标准的16nm步幅常常因为发生在倾斜于平面的微管上，造成二维追踪分析其投影而短于16nm。这就是3D MINFLUX追踪的优势，大大提高了活细胞中分子追踪的空间精度。
图3：对马达蛋白的3D MINFLUX追踪
图中(A)和(B)为三维MINFLUX跟踪简图。A）3D MINFLUX激发光（B）通过7个空间位置检测一个荧光分子的信号强度。(C)和(D)为在固定的U2OS细胞中用motor-PAINT进行三维跟踪。(C)为微管交叉处马达蛋白轨迹的三维渲染。(D)是从(C) 的俯视图和侧视图中选取的轨迹，包括上升和下降的轨迹，以及马达蛋白在微管之间跳跃的两个轨迹(箭头)。(E)和(F)为活细胞中的三维追踪。(E) 在活细胞U2OS中马达蛋白轨迹的俯视图和侧视图，显示了在xy平面和z方向都存在步态运动。(F) 为(E)中轨迹的位置和时间关系，显示步幅为16 nm。比例尺：（E），100 nm；（C）和（D），200 nm。
综上所述，Jonas Ries课题组文章最大的亮点是，利用MINFLUX和motor-PAINT assay建立具有纳米空间和亚毫秒时间分辨率的马达蛋白追踪，并且在活细胞中解析了单个马达蛋白的步幅。在motor-PAINT assay中，细胞经过透化和固定，然后添加荧光标记的马达蛋白。马达蛋白会沿着微管正端运动，其方向性也揭示了微管的方向。Jonas Ries课题组以 2 nm 的精度重建细胞微管。因此，该方法也同时提高了重建微管密集阵列的精度，为今后在活细胞研究马达蛋白在复杂环境中的动力学以及密集微管阵列的超分辨率mapping打下了重要的基础。重要的是，Jonas Ries课题组证明了MINFLUX研究活细胞蛋白质精确运动普适性。他们在肌球蛋白的研究中，也实现了具有最高时空分辨率和较小扰动的精确追踪。值得注意的是，Jonas Ries课题组的文章提到，他们并未在motor-PAINT assay中清晰的观察到4 nm的马达蛋白亚步幅，这可能是因为该assay下的空间分辨率的不足。而4 nm的亚步幅在研发MINFLUX技术的Stefan W. Hell课题组的文章中观察到了，这一发现是在马达蛋白畅行无阻的情形下（无缀连更大的标记物），首次观察到的。本文稍后会更详细的介绍。值得一提的是标记物，在motor-PAINT中，马达蛋白的标记是经由SNAP-Tag（3 nm）实现的，这影响了定位精度和分辨率。
相对于Jonas Ries课题组的活细胞追踪，作为研发MINFLUX技术的Stefan W. Hell课题组来说，他们更希望在传统赛道——体外观测上凭借独有的时空分辨率优势进一步解析马达蛋白Kinesin的精细运动，同时从各个角度追求MINFLUX的性能极限。他们通过使用加强版MINFLUX激发光来检测蛋白质运动，获得高达1.7 nm的定位精度和微秒级时间分辨率，在测量蛋白步进移动时实现0.57 nm的精度，进而直接观测到了马达蛋白8 nm的常规步进（相当于16nm步幅）和4 nm长的亚步进（Substep）现象（相当于8 nm步幅）（图4）。
图4. MINFLUX 对马达蛋白的跟踪显示4nm的蛋白移动步长。
(A) 马达蛋白在微管上行走的示意图，荧光分子标记在马达蛋白杆部。(B) 在 10μM 的ATP 浓度下，沿着微管轴线记录的位置与时间关系。(C) 为(B)中用灰色阴影突出显示的0.36和0.44秒之间数据的放大图。(D) 统计1821步的步进精度（顶部）和步进大小（底部）的直方图。步进精度的中位数是0.57 nm。橙色的虚线显示马达蛋白中心4 nm的短步进和8 nm的常规步进。接着，研究发现当把ATP浓度提高，随着马达蛋白运动加快，常规的8 nm步进并不像之前那么明显，反而是观测到了很多6 nm和10 nm的步进（图5A）。研究人员认为单荧光分子标记在马达蛋白杆部的一侧，且跟杆中心有2 nm左右的距离，6 nm和10 nm的步进是马达蛋白在前进过程中杆部旋转，荧光分子相对杆部在前后来回位移所致。为了印证这一想法，他们在杆部对称位置加入第二个荧光分子，并重新获得8 nm步长（图5B）。
图5. 马达蛋白步进过程中的杆部的旋转
(A) 左图：杆旋转模型解释了单分子标记导致的大步和小步的交替发生。中间：在 1mM ATP 浓度下，单分子标记马达蛋白质在1810步中的统计直方图。右图：单分子标记蛋白连续步进的二维直方图，显示了6nm和10nm步进的交替。(B) 左图：杆旋转模型解释双分子对称标记复现8nm柄位移。中间：在 1mM 的 ATP 浓度下，双分子标记马达蛋白步进跟踪的统计直方图。右图：双分子标记马达蛋白二维直方图，显示主要是8nm步长。
可以看出，Stefan W. Hell课题组文章的亮点是，利用MINFLUX实现了亚毫秒级的马达蛋白构象研究，并且最大程度的减少了标记物对马达蛋白运动的阻碍。Stefan W. Hell课题组利用MINFLUX检测弱荧光团的优势，使用1 nm的单个荧光团偶联到马达蛋白上，这保证了定位精度。重要的是，在这样的标记方法下，马达蛋白是畅行无阻的。相比之下，在以往的研究中，直径30 nm金颗粒虽然能提供足够的时空分辨率，但是体积、阻力、静电作用都阻碍了马达蛋白的运动。我们有理由相信，MINFLUX适用于荧光标记生物分子的任何纳米级变化研究，并作为下一代蛋白质构象变化的研究工具。
这两篇研究为大家全面展示了MINFLUX高精度高速度的追踪能力。其实，MINFLUX所提供的追踪方案并不局限于马达蛋白，由于该技术不需要收集大量光子，与单荧光分子标记技术兼容，适用于捕捉在活细胞中任何蛋白质的精确运动。我们相信， MINFLUX技术将会通过超高的空间和时间分辨率不断地帮助人们解开更多未解之谜。
本文作者李天翊博士来自Abberior Instrument公司,
蒿慧文博士来自Standard Imaging Team-华夏成像公司。
参考文献：
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